充分利用柯勒照明

    在常规复式光学显微镜设置和使用中 ，柯勒照明技术是实现最佳成像的最重要 、最基本的技术之一 。柯勒照明调节是有助于获得均匀照明和好的图像对比度的技术  ，正确调节柯勒照明后 ，可以确保均匀的反差和照明、较高的分辨率以及观察到更多细节 ，能大幅改善图像的质量 。

    尽管这项技术属于操作调节显微镜的常规内容 ，但仍在显微镜使用中具有重要意义 。即使是今天 ，柯勒的均匀照明技术仍然被广泛使用 ，并构成了共聚焦 、相差以及微分干涉相差 (DIC) 显微术等众多技术的基础 。实际上 ，了解两个主要显微镜部件(视场光阑和聚光镜)后 ，完成正确设置就只是几分钟的事情 。

01 、什么是科勒照明 ？

   显微镜的照明对获取准确清晰的图像起着至关重要的作用 ，随着显微镜技术的发展 ，常规的复式显微镜照明方式 ，经历了临界照明和柯勒照明两个重要阶段 。

   临界照明曾经是显微镜行业中的一种占主导地位的技术 ，这种情况一直延续到August Köhler（1866–1948）开发了一种新式照明方式为止 ，这种方式如今被称为柯勒照明 。临界照明的问题在于明亮的灯光源会在被观察标本所在的同一图像平面中产生一种灯丝像 。最终的成像里出现的灯丝像会导致标本照明不均匀, 产生炫光和伪影 。柯勒照明通过将散焦光源图像 ，使光照均匀地照射到标本的方法 ，解决了伪影的问题 ，也极大改善了图像的反差 。

    标本照明不理想 ，会妨碍正确的观察时 ，就需要使用科勒照明 ，这种情况今天仍然适用 。柯勒照明通过使用透射光路或反射光路 ，可以为处于显微镜的明场 、暗场 、以及相差等观察方式中的标本提供均匀照明 。柯勒照明有助于获得均匀照明 、较高的分辨率和优质的标本对比度或反差 。

02 、如何设置和使用科勒照明 ？

    通过调整视场光阑 ，可以将处于焦面中的视场光阑的像大小设置为比样品成像区域的图像稍微大一些 。当视场光阑 、标本和目镜视场光阑都处于同一个共轭图像平面时 ，这种调节可以使照明光线完全进入到目镜视场中 ，并尽可能降低目镜视场光阑对外来光的阻挡 。

反射光显微镜 ：反射光显微镜或称落射光显微镜是为不透光标本所选择的一种照明方式 ，这些标本包括 ：金属 、矿石 、陶瓷 、聚合物 、半导体（如 ：未加工的硅 、晶圆 、集成电路） 、复合材料 、煤炭 、塑料和涂料等 。

    在反射光显微镜中设置柯勒照明所需的主要光学元件的排列方向正好与在透射光显微镜中这些元件的排列方向相反 。孔径光阑要接近光源 ，而视场光阑接近标本 。在反射光显微镜中 ，物镜有双重作用 ：光线从上向下时 ，物镜起到的是一种正确对焦的聚光镜的作用 ，可以控制光线照射在标本上的角度 。光线反射回来从下向上时 ，物镜的数码孔径（NA）可以确定捕获从标本反射回来的光线的角度 。如果所有其它条件都相同 ，则数值孔径越高 ，物镜的分辨率就会越好 ，图像的分辨率也就越好 。

03 、基于科勒照明的显微镜观察方法

暗场显微镜 ：暗场显微镜利用斜射照明 ，非常适用于样品散射的光的观察 。未被样品散射的光不会由物镜收集 ，也不会进入到图像中 。样品的这部分区域显得很暗 。而发生散射的部分从目镜观察是明亮的 。暗场显微镜的主要局限性是图像中可见光的成像较弱 。这就是科勒照明技术发挥作用的方式 ：均匀的光线照亮样品 。样品的边界部分被照亮 ，适合观察一些裂缝 ，边界或基于散射衍射而明亮的颗粒 。

相差显微镜 ：这是一种常用光学显微镜技术 ，这种技术通过表达来自样品的不同的光程差的大小体现出来的图像变化 。基于样品的不同属性 ，通过物镜和聚光镜相差环板位置造成光线干涉发生变化 ，相位出现偏差 。对应产生明暗的变化，显示图像 。相差显微镜在工业显微镜行业中也非常重要 ，因为它可以使在明场显微镜中看不到的很多样品特性或结构显现出来 ，比如高分子聚合或是包裹体观察等 。

微分干涉相衬（DIC）显微镜 ：这是一种新型的位相差干涉成像方式 。微分干涉相衬显微镜通过偏光+微分干涉棱镜的方式 ，通过偏光的双折射现象并产生干涉 ，加强了反差效果 ，使得样品表面高低通过位相差的不同表现得很明显 。要获得微分干涉图像，需将偏振光通过微分干涉棱镜分为两束互相垂直的部分 ，通过样品后 ，发生相位变化 ，然后在被观察到之前再通过微分干涉棱镜被重新组合到一起 。两个部分在重新组合过程中的互相干涉 ，对它们之间微小的光程差很敏感 。从而观察到样品的具有三维立体感的类浮雕图像 。并且通过相位的调节 ，可以看到不同的干涉色 ，达到最佳的观察效果 。

        小技巧 ，大作用 ，正确的调节显微镜 ，可以事半功倍 ，极大地改善观察效果 ，提高工作效率 。